Noi descoperiri şi statusul actual al terapiei genice ce utilizează vectorii virali, în Marea Britanie

Vectorii virali reprezintă vehiculul de elecţie al transferului de gene în studiile clinice despre terapiile genice efectuate în Marea Britanie şi în întreaga lume. Doar în Marea Britanie sunt înregistrate 88 de studii clinice la Gene Therapy Advisory Committee (Comisia de Consultanţă asupra Terapiilor Ge-nice - GTAC), www.advisorybodies.doh.gov.uk/ genetics/gtac.

Cu toate că s-au obţinut succese notabile în anumite boli ereditare, utilizarea vectorilor virali nu este lipsită de riscuri. Am trecut în revistă reacţiile adverse înregistrate până în prezent pentru ca, analizându-le implicaţiile, să putem îmbunătăţi biologia şi farmacologia vectorilor, în perspectiva transformării terapiei genice cu vectori virali într-un mijloc terapeutic viabil.

Sursele şi criteriile de selecţie

Cu ajutorul Medline şi Google am căutat materialele care conţin termenii "terapie genică" şi "vectori virali". Am studiat şi paginile web www.wiley.co.uk/genmed/clinical şi www.advisorybodies.doh.gov.uk/genetics/gtac pentru a găsi informaţii asupra studiilor controlate despre vectorii virali, aflate în curs de desfăşurare, în Marea Britanie.

Terapia genică virală: succese şi eşecuri

În aprilie 2002, serviciul BBC de ştiri online din Marea Britanie transmitea un titlu cu o puternică încărcătură emoţională: "Băiat condamnat să trăiască sub un clopot steril, salvat de terapia genică".1 Era vorba despre un băieţel în vârstă de 18 luni, care prezenta o boală imună rară, sindrom de imunodeficienţă combinată severă, X linkată (X-SCID), determinată de un defect genetic de pe cromozomul X. Respectiva genă codifică lanţul C, care este o componentă esenţială a cinci receptori citokinici necesari pentru dezvoltarea limfocitelor T şi NK (natural killer). Dacă nu există lanţul C, limfocitele T mature şi NK sunt complet absente, în timp ce limfocitele B sunt, de obicei, prezente la valori normale sau crescute. X-SCID are o evoluţie letală, în primul an de viaţă, prin infecţii recurente severe. De aceea, copiii îşi petrec cea mai mare parte a timpului, în scurta lor viaţă, sub un clopot steril de plastic, o barieră în calea organismelor infecţioase ce le pot pune în pericol viaţa. Un grup de oameni de ştiinţă din Londra, Paris şi Milano au folosit un vector retroviral pentru introducerea unei copii funcţionale a genei defective în celulele stem din măduva spinării recoltată de la pacient, în speranţa că, după reinfuzie, se vor grefa şi vor reconstitui un sistem imun normal.2, 3 Integrarea şi expresia transgenei C şi dezvoltarea subgrupurilor limfocitare şi a funcţiilor acestora au fost analizate pe o perioadă de 2,5 ani de la transferul genic. Nu s-au înregistrat reacţii adverse imediate în urma procedurii. Numărul şi caracteristicile limfocitelor T, precum şi răspunsul proliferativ in vitro faţă de câteva antigene au fost aproape normale după doi ani. Tratamentul a fost considerat un succes şi un pas important pentru terapia genică, întrucât a utilizat o procedură in vivo mai veche, dar care nu a presupus transferul direct in vivo al vectorului.

Cu toate acestea, în ultimul an, doi din cei 10 copii trataţi în Franţa pentru X-SCID au dezvoltat afecţiuni pseudoleucemice.4 Analiza genetică a celulelor maligne a demonstrat că vectorul retroviral, folosit pentru a transportul copiei funcţionale a genei defective a lanţului C în celulele stem ale măduvei spinării, s-a inserat în ADN-ul pacienţilor şi a activat oncogena LIM-only2 (LMO2), care se asociază cu leucemia, la copii. Deşi nu a fost singura cauză a malignităţii, activarea prin inserţie a fost considerată a reprezenta unul dintre evenimentele care o pot declanşa. Este important să subliniem, însă, că astfel de afecţiuni leucemice, asociate terapiei genice, pot fi monitorizate clinic.

Preocupări similare a avut, recent, şi Mark Kay de la Universitatea Stanford din SUA. În martie 2000 au fost publicate rezultatele încurajatoare obţinute în prima fază a unui studiu clinic controlat în care virusul adeno-asociat (AAV) utilizat exprimă gena pentru factorul IX al coagulării sangvine (FIX): vectorii AAV recombinaţi sunt consideraţi a fi unii dintre cei mai siguri agenţi folosiţi în terapia genică, întrucât virusul nu determină boala la oameni în mod natural şi rareori se integrează aleator în genom. La unul dintre pacienţii din studiu, necesarul de factor IX administrat s-a putut reduce cu 50%, iar la altul, cu 80%.5

Idei principale
 
În Marea Britanie, în 74% din totalitatea studiilor clinice asupra terapiilor genice sunt utilizaţi vectori virali, dintre care majoritatea în tratamentul cancerului
 
Date fiind recentele obstacole, este necesară intensificarea eforturilor în direcţia îmbunătăţirii siguranţei utilizării vectorilor virali
 
Aceasta înseamnă reducerea riscului de mutageneză şi orientarea expresiei genelor terapeutice în anumite ţesuturi specifice, utilizând atât tehnici de transcripţie cât şi de transducţie
 
Până în prezent, în studiile clinice controlate asupra terapiilor genice, efectuate în Marea Britanie, nu au fost semnalate reacţii adverse serioase
 
Având în vedere monitorizarea eficientă a studiilor clinice controlate şi permanenta îmbunătăţire a vectorilor virali, terapia genică poate reprezenta, în diferite afecţiuni, o alternativă reală la tratamentele convenţionale

Cu toate acestea, în iunie 2003, Kay şi colaboratorii au publicat un studiu efectuat pe şoareci, care a arătat că vectorul utilizat în respectivele studii clinice se integrează mai frecvent în regiunile ADN-ului care conţin gene decât în cele fără codificare genică.6 Situsurile de integrare au fost distribuite în genomul şoarecelui fără vreo preferinţă particulară pentru un anumit cromozom. Totuşi, a fost evident faptul că integrarea a avut loc în genele active. Aceasta a arătat că vectorul AAV ar putea genera defecte celulare similare celor care au generat producerea cancerului la pacienţii cu SCID. Pe lângă vectorii retrovirali şi AAV, s-au înregistrat probleme şi în cazul vectorilor adenovirali. Decesul unui tânăr din SUA, Jesse Gelsinger, a fost atribuit efectelor toxice ale vectorului adenoviral folosit pentru tratamentul deficienţei de ornitin-transcarbamilază (OTC).7

Statusul actual al terapiei genice virale în Marea Britanie

În ciuda rapoartelor recente, domeniul terapiei genice a stăbătut, în ultimul deceniu, un drum foarte lung. S-a îmbunătăţit eficienţa transferului genic şi sunt în curs de cercetare, în fază de studii preclinice, numeroşi noi vectori. Cei virali rămân transportorii de elecţie pentru transferul genic, în studiile din Marea Britanie şi din întreaga lume. În tabelul 1 sunt prezentate studiile clinice aflate în curs de desfăşurare în Marea Britanie. Dintre cele 88 de studii controlate din Marea Britanie, înregistrate la GTAC, în 75% (66) se utilizează vectori virali; majoritatea sunt folosite în tratamentul cancerului.

Vectori adenovirali

Adenovirusurile rămân cei mai populari vectori virali ai studiilor clinice, întrucât au capacitatea de a transduce o gamă variată de celule care se divid sau nu. În plus, se replică epizomal şi nu-şi inseră genomul în cel al celulelor gazdei, determinând mai puţine modificări ale genelor celulare vitale. Cu toate acestea, vectorii adenovirali sunt cei mai imunogeni dintre toţi vectorii virali care se folosesc la ora actuală. În cazul Gelsinger, decesul a fost datorat unui răspuns inflamator excesiv la prima generaţie de vectori adenovirali. Prin urmare, oamenii de ştiinţă s-au străduit să rezolve astfel de probleme şi au îndepărtat toate genele virale neesenţiale, rezultând generaţia a treia de vectori. Studiile efectuate pe creier de şobolan au demonstrat, însă, că proteinele capsidei adenovirale pot declanşa un răspuns imun. Situaţiile în care vectorul poate declanşa un răspuns imun sunt corelate cu doza administrată: urgenţa maximă este să stabilim doza de administrare a vectorului. Totuşi, datorită variabilităţii răspunsului imun la oameni, este dificil să apreciem cantitatea de vector care trebuie administrată. Aşa s-a întâmplat în cazul Gelsinger. Tânărul a primit cea mai ridicată doză de vector din studiu (3,8x1013 particule virale), în timp ce unui alt pacient i s-a dat o doză similară (3,6x1013 particule virale), dar fără să se înregistreze efecte secundare. Ca urmare a evenimentelor din SUA, UK Gene Therapy Advisory Committee a alcătuit un comitet de lucru pentru studiul adenovirusurilor, care a elaborat câteva recomandări, printre care şi necesitatea monitorizării, înainte şi după administrarea vectorului, a statusului imun şi a profilului citokinelor la pacienţii recrutaţi în studiu, pentru a încerca evaluarea reacţiilor acestora la tratament. O altă recomandare a fost aceea de standardizare a metodelor de determinare a titrului viral, de către comisiile de cercetare, pentru asigurarea consistenţei tuturor studiilor clinice.8

Studii controlate clinice în curs de desfăşurare în Marea Britanie. Martie 2004 (surse: pagina web a Journal of Gene Medicine, www.wiley.co.uk/genmed/clinical; şi a Gene Therapy Advisory Committee www.advisorybodies.doh.gov.uk/genetics/gta)

Investigatorul Centrul Virusul Boala Gena Faza Anul aprobării
James Queen Elizabeth Hospital, Birmingham Adenovirus Neoplasme de la nivelul capului şi gâtului Nitroreductază 1 1999
James Queen Elizabeth Hospital, Birmingham Adenovirus Cancer hepatic Nitroreductază 1 1999
Riddell St Georges Hospital, London Adenovirus Boală arterială ocluzivă periferică Factor de creştere fibroblastică (FGF) 1 2000
Link Beatson Oncology Centre, Glasgow Adenovirus Neoplasme de la nivelul capului şi gâtului Deleţie E1b II 1997
Morris University Hospital NHS Trust, Birmingham Adenovirus Cancer ovarian Nitroreductază I 1998
Chanon John Radcliffe Hospital, Oxford Adenovirus Revascularizaţie incompletă post-bypass coronarian Hypoxia inducible factor (HIF)-1alpha I 2000
James Queen Elizabeth Hospital, Birmingham Adenovirus Cancer prostatic Nitroreductază I 2001
Habib Hammersmith Hospital Adenovirus Carcinom hepatocelular Deleţie E1b I ns
Rampling Beatson Oncology Centre, Glasgow Herpes simplex virus Gliom nivel înalt Deleţie ICP34.5 I 2000
Harris John Radcliffe Hospital, Oxford Herpes simplex virus Melanom malign Factor de stimulare a coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF) I 2000
Brown University of Glasgow Herpes simplex virus Neoplasme de la nivelul capului şi gâtului Deleţie CP34.5 II 2001
Brown University of Glasgow Herpes simplex virus Neoplasme de la nivelul capului şi gâtului Deleţie CP34.5 II 2001
Coombes, Pandha, Harrington St George's Hospital Medical School, London Herpes simplex virus Melanom, cancer mamar, neoplasme la nivelul capului şi gâtului, limfom non-Hodgkin Deleţie ICP34.5 Deleţie ICP47 Deleţie GM-CSF I 2001
Evans University of Glasgow, Beatson Oncology Centre, Glasgow Herpes simplex virus Mezoteliom Deleţie ICP34.5 I 2002
Harris John Radcliffe Hospital, Oxford Retrovirus Melanom metastatic HSV-tk I -
  Hammersmith Hospital, London Retrovirus Leucemie mieloidă cronică HSV-tk I 2000
Thrasher Institute of Child Health, London Retrovirus X-SCID Receptor al lanţurilor gamma c comune I 2001
Thrasher Institute of Child Health, London Retrovirus Boli granulomatoase gp91phox I 2000
Steven Queen Elizabeth Hospital, Birmingham; Churchill Hospital, Oxford Retrovirus Cancer mamar, melanom Citocrom p450 I 2001
- Churchill Hospital, Oxford Retrovirus Cancer prostatic Citocrom p450 I 2001
Lotze Queen Elizabeth Hospital, Birmingham Vaccinia virus Cancer colorectal Antigen carcinoembrionar (CEA) I 1998
Freeman University of Cardiff, Cardiff Vaccinia virus Neoplazie cervicală intraepithelială III Human papilloma virus (HPV) E6 şi E7 I 1996
Goh GlaxoSmithKline Vaccinia virus Infecţie HIV HIV1-Env III 2000
- - Vaccinia virus Cancer colorectal avansat Antigen oncofetal 5T4 II 2004
Harris Churchill Hospital, Oxford Vaccinia virus Melanom Mel3 I 2000
- - Vaccinia virus Cancer cervical Human papilloma virus (HPV) E6 şi E7 I 2001
Steven Institute of Cancer Studies, Birmingham Vaccinia virus Carcinom nazofaringian - I 2002

Vectorii retrovirali

Vectorii retrovirali sunt utilizaţi într-o varietate de studii clinice efectuate în Marea Britanie. Unul dintre avantajele folosirii retrovirusurilor este că deţin capacitatea de-a se integra în genom şi de-a rămâne exprimate pentru o perioadă îndelungată de timp. Conform comunicărilor recente, însă, riscul oncogenezei induse de integrarea retrovirală este, în mod clar, mai mare decât s-a estimat anterior. Prin urmare, asemenea riscuri trebuie diminuate prin anumite strategii, precum orientarea integrării în regiunile inactive ale genomului gazdei.8 O posibilă abordare ar fi folosirea modalităţilor de integrare specifice bacteriofagilor C31, care au fost utilizaţi, recent, pentru integrarea de fragmente non-virale în celulele de şoarece şi umane.9

Replicarea vectorilor virali competenţi

Utilizarea vectorilor virali non-replicativi poate limita considerabil numărul de celule avizate. De aceea, s-a dezvoltat replicarea vectorilor virali competenţi, care să permită furnizarea de gene către un număr redus de celule şi transferul ulterior la celulele alăturate, pe măsură ce infecţia se răspândeşte. Asemenea strategii s-au dovedit a fi eficiente în special în tratamentul cancerului, pe modele preclinice. Vectorului adenoviral ONYX-015 i se efectuează o deleţie în regiunea E1B, care se leagă de p53 şi o inactivează. În condiţii normale de replicare virală, adenovirusul se ataşează la p53 şi o inactivează pentru a asigura o replicare eficientă. Prin urmare, teoretic, ONYX-015 este incapabil de replicare în celulele normale, dar în cele canceroase, în care există o deleţie p53, virusul este capabil de replicare şi poate determina liza celulară.10 Situaţia nu mai este, însă, la fel de clară cum s-a crezut iniţial, întrucât s-a demonstrat că virusul se poate replica în celulele p53 de tip sălbatic. În prezent, ipoteza este testată, în Marea Britanie, în tratamentul cancerelor de cap, gât şi hepatic, iar cercetările i-au arătat atât limitele cât şi aspectele ce se impun a fi aprofundate. Problemele sunt create, de pildă, de gradul redus de transducţie al celulelor tumorale, datorită capacităţii lor slabe de exprimare a receptorilor adenovirusului Coxsackie (CAR), necesar pentru pătrunderea adenovirusului. Sunt în curs de elaborare noi variante ONYX-015 care să nu mai necesite infectarea tuturor celulelor tumorale pentru asigurarea remisiei complete. Ele au fost proiectate pentru a furniza celulelor tumorale proenzime de conversie. Virusul herpes simplex (HSV) oncolitic competent replicativ este, de asemenea, un vector popular, folosit curent, în Marea Britanie, în câteva studii clinice asupra terapiei genice a cancerelor. HSV1 este un virus de dimensiuni mari, cu ADN dublu catenar ce codifică cel puţin 89 de proteine. Are un mare tropism celular şi rămâne extracromozomial, minimalizând, prin urmare, riscul de mutageneză inserţională. Multe dintre virusurile competent replicative care au fost studiate au prezentat deleţia genei ICP34.5 şi sunt predispuse să se replice în celulele tumorale, dar nu şi în ţesturile adiacente normale.

Replicarea virală conduce la liză celulară, care eliberează un al doilea val de virusuri ce pot infecta celulele tumorale adiacente. Descoperirea acestor vectori pare promiţătoare şi nici nu au fost semnalate, până în prezent, reacţii adverse.

Lecturi suplimentare
 
Articole
 
Cavazzana-Calvo M, Thrasher A, Mavilio F. The future of gene therapy. Nature 2004;427:779-81.

 
Thomas CE, Ehrhardt A, Kay MA. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nature Rev Genet 2003;4:346-58.

 
Lundstrom K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol 2003;213:117-22.

Surse utile de informare şi paginile de web corespunzătoare
 
Journal of Gene Medicine
(http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical
- Conţine informaţii despre toate studiile clinice încheiate sau în curs de desfăşurare, din întreaga lume

 
Gene Therapy Advisory Committee
(http://www.advisorybodies.doh.gov.uk/genetics/gtac
- Conţine informaţii despre toate studiile clinice încheiate sau în curs de desfăşurare, din Marea Britanie

Informaţii pentru pacienţi

 
www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/
medicine/genetherapy.shtml
- Conţine informaţii de bază despre terapia genică şi legături cu alte pagini web

 
Cancer BacUp
(http://www.cancerbacup.org.uk/
-Conţine informaţii despre toate tipurile de cancer, precum şi date despre studiile controlate privind terapia genică în cancer

Proiecte viitoare ale terapiei genice virale

În ciuda cazurilor X-SCID şi Gelsinger, în Marea Britanie nu au fost semnalate, până în prezent, reacţii adverse severe. Faptul se datorează, parţial, numărului mic de pacienţi trataţi. Este important să învăţăm din astfel de cazuri şi să ne îmbogăţim nivelul de cunoaştere a biologiei şi farmacologiei vectorilor. Deşi GTAC deţine rolul central în controlul studiilor despre terapiile genice din Marea Britanie, există opinii ce solicită materializarea unei legislaţii comune în statele europene, precum şi în SUA.11 Este limpede că se impun noi eforturi în direcţia îmbunătăţirii vectorilor, astfel încât să prevenim riscul mutagenezei de inserţie şi, de asemenea, să orientăm exprimarea genelor terapeutice în ţesuturi specifice, folosind tehnici de transcripţie şi de transducţie. Se vor reduce, astfel, dozele vectorilor şi potenţiala lor imunogenicitate.

În ciuda obstacolelor, succesele au început să apară. Dintre cei 18 pacienţi cu SCID trataţi pentru o asemenea afecţiune ce poate pune în pericol viaţa bolnavului, 17 au supravieţuit şi au un sistem imun sănătos, funcţional, de până la cinci ani, şi o bună calitate a vieţii. Pe lângă condiţiile monogenice, terapia genică reprezintă un tratament viabil şi pentru bolile poligenice, precum cancerul, fie ca terapie unică, fie suplimentară sau în combinaţie cu chemoterapia sau radioterapia. Mai este încă foarte mult de muncă, dar asigurând o monitorizare atentă a studiilor clinice şi îmbunătăţind continuu vectorii virali, terapia genetică poate să reprezinte o importantă măsură terapeutică într-o gamă variată de boli.

Contribuţii: HP este responsabil pentru propunerea articolului, pentru comentariile critice şi pentru acceptarea materialului final. El este garantul lucrării. KR a documentat şi a redactat articolul. KH este responsabil pentru comentariile critice şi recomandările asupra articolului.

Finanţare: Nici una.

Conflict de interese: Nici unul declarat.

Recent developments and current status of gene therapy using viral vectors in the United Kingdom

BMJ 2004;329:839-42

Department of Oncology, St George's Hospital Medical School, London SW17 0RE
Hardev Pandha
senior lecturer in medical oncology
Kate Relph scientific writer
Institute Cancer Research, London SW7 0RP
Kevin Harrington
team leader, Targeted Therapy, Cell and Molecular Biology
Correspondence to: H Pandha hpandha@sghms.ac.uk

Bibliografie

1 BBC Online News. "Bubble boy" saved by gene therapy. 3 April 2002, http://news.bbc.co.uk/1/hi/health/1906999.stm (accessed 20 Aug 2004).

2 Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G, Gross F, Yvon E, Nusbaum P, et al. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science 2000;288:669-72:

3 Aiuti A, Slavin S, Aker M, Ficara F, Deola S, Mortellaro A, et al. Correction of ADA-SCID by stem cell gene therapy combined with nonmyeloablative conditioning. Science 2002;296:2410-3..

4 Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, McCormack MP,Wulffraat N, Leboulch P, et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science 2003;302:415-9.

5 Kay MA, Manno CS, Ragni MV, Larson PJ, Couto LB, McClelland A, et al. Evidence for gene transfer and expression of factor IX in haemophilia B patients treated with an AAV vector. Nature Genet 2000;24:257-61.

6 Lehrman S. Virus treatment questioned after gene therapy death. Nature 1999;401517-8.

7 Kay MA, Nakai H. Looking into the safety of AAV vectors. Nature 2003;424:251.

8 Bushman F. Targeting retroviral integration. Mol Ther 2000;6.

9 Olivares EC, Hollis RP, Chalberg TW, Meuse L, Kay MA, Calos MP. Sitespecific genomic integration produces therapeutic factor IX levels in mice. Nature Biotech 2002;20:1124-8.

10 Ries, S and Kirn, W M. ONYX-015: mechanisms of action and clinical potential of a replication selective adenovirus. Br J Cancer 2002;86:5-11.

11 Cavazzana-Calvo M, Thrasher A, Mavilio F. The future of gene therapy. Nature 2004;427:779-81.

Rate this article: 
Average: 4.5 (2 votes)
Bibliografie: 
Traducere: 
Dr. Olguţa Iliescu
Autor: